Hewan
Segala penggunaan hewan telah disetujui oleh Komite Etika Hewan dari Universitas Tasmania (permohonan 21736) dan dilakukan sesuai dengan Kode Praktek Australia untuk Perawatan dan Penggunaan Hewan untuk Tujuan Ilmiah (2013). Tikus Sprague Dawley dibesarkan oleh Fasilitas Penelitian Hewan Universitas Tasmania dan ditempatkan di dalam kandang ventilasi individu dengan siklus cahaya/kegelapan 12 jam dan akses bebas ke makanan dan air. Tikus neonatal dan embrio dari kedua jenis kelamin digunakan untuk persiapan kultur astrosit dan neuron, masing-masing.
Pembuatan Perangkat Mikrofluida Co-culture
Seperti yang diilustrasikan dalam Gambar 1a–c, platform kultur mikrofluida neuron-astrosit tiga kompartemen yang diusulkan terdiri dari dua kompartemen neuron/astrosit (kiri dan kanan, masing-masing 1,5 mm–1,5 mm per kompartemen) yang terhubung ke kompartemen ketiga hanya astrosit (bagian bawah, 1,5 mm–3,5 mm) melalui struktur berlabirin. Struktur berlabirin ini dirancang untuk menghambat pertumbuhan akson dan mencegah koneksi sinaptik antara dua populasi neuron, sambil memungkinkan infiltrasi astrosit di semua kompartemen. Sebuah fitur kunci dari perangkat ini adalah kapasitas untuk menjaga periode isolasi fluidik yang berkelanjutan antara kompartemen, yang dicapai melalui 6 reservoir fluida (diameter 6 mm) yang mengatur tekanan hidrostatik dan aliran fluida.
Untuk membuat perangkat, cetakan utama dibuat pada substrat poli (metil metakrilat) (PMMA; RS components Pty Limited) (75 mm–50 mm–2 mm) menggunakan dua tahap fotolitografi. Pertama, PMMA dilapisi tipis dengan lapisan fotoresist (SU-8 2005, Microchem), dipanggang ringan, terpapar berlebihan, dan kemudian dipanggang kembali untuk membentuk permukaan yang lengket untuk lapisan kedua. Proses ini segera diulang dengan lapisan fotoresist yang lebih tebal (SU-8 3025, Microchem), terpapar dengan masker transparansi resolusi tinggi, dan dikembangkan untuk menghasilkan lapisan kedua yang terdiri dari larik berlabirin 10 bank yang terselip (dimensi: tinggi=75 µm, lebar=50 µm, panjang=250 µm, interval reguler=50 µm pada sumbu Y dan jarak antara bank=150 µm pada sumbu X), sebuah kompartemen hanya astrosit (tinggi=75 µm, lebar=1,5 mm, panjang=3,5 mm) dan dua kompartemen kultur co-culture (tinggi=75 µm, lebar=1,5 mm, panjang=1,5 mm). Cetakan dipanggang, dikembangkan, dan dipanggang keras. Replikasi perangkat difasilitasi oleh litografi lunak menggunakan agen pengeras pre-poli mer, poli-dimetilsiloksan (PDMS) (campuran 10:1, Sylgard 184, Dow Corning, Inc), diikuti oleh pengerasan pada 70°C semalaman. Setelah direplikasi, reservoir untuk media kultur dibentuk menggunakan biopsy punch (diameter 6 mm, Kai Medical).
Profilometri Permukaan
Perangkat mikrofluida PDMS yang direplikasi dari cetakan utama diperiksa di bawah mikroskop profilometer optik Wyko NT9100 (Veeco Instrument Inc.) untuk memverifikasi dimensi saluran dan menilai kesetiaan struktur berlabirin yang terbentuk selama proses replikasi. Pemetaan profil optik dianalisis dengan menggunakan profil optik led ganda dalam interferometri pemindaian vertikal (VSI) dengan lensa objektif 5X.
Perakitan Pra-kultur dan Persiapan Perangkat Mikrofluida
Perangkat mikrofluida dibersihkan dengan pita perekat dan dicuci dengan etanol 70% semalaman sebelum dipaparkan dengan sinar UV selama 30 menit. Perangkat dipersatukan secara tak terbalik pada penutup kaca steril (24 mm², Thermo Fisher Scientific) menggunakan unit plasma udara portabel (Electro Technic Products Inc). Perangkat yang sudah disatukan kemudian dilapisi dengan 0,001% poli-L-lisin (PLL) dalam Larutan Buffer Fosfat Borat 0,01 M (PBS) untuk mempromosikan kelekatan sel, dan diinkubasi (37°C, 5% CO₂) selama 24 jam sebelum dicuci dengan milli-Q steril dan penambahan media kultur sel yang sesuai.
Sebelum penanaman neuron kortikal primer, perangkat diisi dengan media pertumbuhan neuron (NGM) yang mengandung Neurobasal™ disuplementasi dengan 2% v/v B27, 0,5 mM glutamax, 25 μM L-glutamat, dan 1% v/v penisilin/streptomisin (semuanya dari Thermo Fisher Scientific). Sebelum menanam astrosit, perangkat diisi dengan media pertumbuhan glial (GGM) yang mengandung DMEM (Thermo Fisher Scientific) disuplementasi dengan 10% v/v FBS dan 1% penisilin/streptomisin. Untuk kultur co-culture neuron dengan astrosit, astrosit dibiarkan tumbuh dalam perangkat selama satu minggu dengan GGM, 24 jam sebelum penambahan neuron, media diganti dengan NGM yang dimodifikasi disuplementasi dengan 10% v/v FCS (Thermo Fisher Scientific).
Konfirmasi Isolasi Fluidik
Efisiensi isolasi fluidik diukur secara tidak langsung dengan mengamati perubahan intensitas fluoresensi garam natrium fluorescein (FI) yang dimuat ke dalam kompartemen co-culture kiri. FI diencerkan menjadi 1 mg/mL dalam PBS 0,01 M dan ditambahkan ke reservoir A1. Isolasi fluidik dicapai dengan mempertahankan volume cairan dari kedua sumuran atas (reservoir A1 dan A2) kompartemen co-culture pada tingkat yang lebih rendah (total volume 10 µL) daripada kompartemen hanya astrosit (reservoir C1 dan C2; 20 µL), sementara kompartemen tengah (reservoir B1 dan B2) tetap kosong. Sinyal fluoresen diambil gambar selama 25 menit menggunakan mikroskop fluoresensi terbalik Nikon Eclipse TI-U, dilengkapi dengan perangkat lunak NIS-Elements BR 3.10 (Melville) dan dilengkapi dengan kamera CCD warna definisi tinggi (Nikon). Pencitraan dilakukan di bawah lensa objektif 10X dengan kubus filter (Semrock, Rochester) yang terdiri dari filter pas-band eksitasi (488±10 nm), filter emisi (520±10 nm), dan cermin dichroic. Wilayah minat (ROI) ditentukan, dan perubahan intensitas fluoresensi (a.u.) diukur menggunakan FIJI (NIH). Untuk menguji isolasi fluidik dari kompartemen hanya astrosit, kami membalikkan perbedaan tekanan hidrostatik dengan menambahkan 10 µL ke kompartemen co-culture (reservoir A1 dan A2) dan memperkenalkan larutan FI terlokalisir ke reservoir C1 dan C2. Kami kemudian mengambil gambar sisi kiri kompartemen co-culture dan struktur berlabirin dalam perangkat. Selain itu, kami juga menganalisis absorbansi fluoresensi larutan dari setiap kompartemen menggunakan fluorometer pembaca pelat otomatis Fluostar Optima (BMG LABTECH), diatur untuk eksitasi 460 nm dan deteksi emisi 515 nm untuk FI setelah perlakuan FI terlokalisir selama 15 menit untuk reservoir kompartemen A1.
Co-culture Astrosit dan Neuron Kortikal
Perangkat mikrofluida kami ditinggali oleh astrosit primer, neuron kortikal, atau kultur co-culture neuron/astrosit, sesuai dengan jadwal waktu yang diuraikan dalam Fig. S1. Untuk mendapatkan kultur astrosit, sel glial campuran primer dipersiapkan dari korteks tikus yang berusia hari postnatal 2–3 (P2–3), seperti yang dijelaskan sebelumnya, dengan modifikasi minor. Meninges dihilangkan, dan jaringan kortikal di diaspasi di trypsin 0,0125% pada 37°C selama 5 menit. Trypsin dinonaktifkan dengan GGM, dan jaringan secara mekanis di diaspasi. Suspensi sel disaring melalui saringan 70 µm dan dipusing (5 menit, 300 rcf, suhu ruangan). Pelet sel di diaspasi dalam GGM segar dan ditanamkan ke dalam Labu T75 yang sebelumnya dilapisi dengan 0,001% PLL dalam PBS. Pada hari ke-7–8, saat mencapai kepadatan penuh, labu digoncangkan pada 200 rpm, 37°C, semalaman untuk memisahkan glia non-astrosit dari lapisan astrosit. Sel glial yang lepas dihilangkan, dan astrosit diambil menggunakan tripsin/EDTA 0,05% (Sigma). Sel dimuat ke dalam kompartemen hanya astrosit dan co-culture perangkat mikrofluida melalui reservoir B1, B2, C1, dan C2 dengan kepadatan 5–10^6 sel. GGM dipulihkan setiap 3 hari.
Neuron kortikal dipersiapkan dari embryonic day 18 (E18) Sprague Dawley rats seperti yang dijelaskan sebelumnya. Setelah disseksi, korteks di diaspasi dengan tripsin 0,0125% pada 37°C selama 5 menit, dicuci dengan NGM dimodifikasi dan ditriturasi. Reservoir C1 dan C2 diisi dengan 20 µL NGM yang sudah dipanaskan. Neuron kortikal (6–10^6 sel) diambil ke dalam 10 µL NGM yang sudah dimodifikasi dan kemudian ditanamkan ke dalam kompartemen co-culture melalui reservoir A1 dan A2. Dengan mempertahankan level media di kompartemen hanya astrosit lebih tinggi daripada kompartemen lain, tekanan hidrostatik mencegah neuron terdisosiasi masuk ke dalam labirin cairan. Setelah penanaman, neuron diinkubasi pada 37°C, 5% CO₂, selama 5 menit untuk memungkinkan adherensi. Semua kompartemen kemudian diisi perlahan dengan NGM yang sudah dipanaskan. Kultur tumbuh pada 37°C, 5% CO₂, dan NGM yang dimodifikasi diganti 3 kali seminggu.
Untuk mempersiapkan media terkondisi asam kainat (KA), neuron kortikal primer dikultur seperti di atas, dengan sel yang telah di diaspasi pada kepadatan 3–10^5 sel per selipan bundar 12 mm. Kultur dipertahankan pada 37°C dengan 5% CO₂, dan NGM diganti 3 kali seminggu. Pada 7 hari in vitro (DIV), 1 mM KA diaplikasikan pada lapisan sel neuron selama 15 menit pada 37°C, 5% CO₂. Lapisan sel kemudian dicuci dengan NGM segar dan diinkubasi selama 6 jam tambahan di bawah kondisi yang sama. Media terkondisi KA yang dihasilkan dikumpulkan dan diaplikasikan ke kultur neuron/astrosit dalam perangkat mikrofluida selama 15 menit.
